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                超氧化物岐化酶(SOD)的應用方案

                提供者:上海美析儀器有限公司   發布時間:2022/5/5 8:54:50  閱讀次數:50次   進入該公司店鋪

                 

                超氧化物岐化酶(SOD)的應用方案(三氮藍四唑NBT法測定)

                引言:

                SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD:Mn-SODCu.Zn-SOD,它們都催化下列反應:由于超氧自由基(02)為不穩定自由基,壽命短,測定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產生超氧自由基負離子02-..-,當加入NBT后,在光照條件下,與超氧自由基反應生成單甲躦(黃色),繼而還原生成二甲躦,它是一種藍色物質,在560nm波長下有da吸收。當加入SOD時,可以使超氧自由基與H結合生成H2O202,從而抑制了NBT光還原的進行,使藍色二甲攢生成速度減慢。通過在反應液中加入不同量的SOD酶液,光照--定時間后測定560nm波長下各液光密度值,抑制NBT光還原相對百分率與酶活性在一定范圍內呈正比。反應液藍色愈深,說明酶活性愈低。

                儀器及試劑

                美析UL-1000超微量紫外可見分光光度計

                離心機

                0.05mol/L 磷酸緩沖液(PBS,pH7.8):

                A母液: 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液:NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分 別用蒸餾水定容到1000ml。

                0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,

                B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸餾水定容至1000ml。

                14.5mM甲硫氨酸溶液:稱取1.0818g Met用磷酸緩沖液(pH7.8)定容至500ml。

                3mM EDTA-Na2溶液:稱取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。

                60μM核黃素溶液:稱取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml,避光保存。

                2.25mM氮藍四唑(NBT)溶液:稱取0.092g NBTPBS定容至50ml,避光保存。

                實驗步驟

                1.酶液提取

                稱取0.5g (可視情況調整)樣品(新鮮葉片或根系)洗凈后置于預冷的研缽中,分三次加入10ml 50mmol/L預冷的磷酸緩沖液(pH7.8) 在冰浴上研磨成勻漿,轉入離心管中在4C、12000g 下離心20min,.上清液即為SOD粗提液。

                2.酶活性測定

                (1)反應混合液配制(60個樣為準):分別取配好的Met溶液162ml,.EDTA-Na2溶液6ml,NBT 溶液6ml,核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻;

                (2)分別取2.9ml反應混合液和0.1ml (可視情況調整)酶液于指形管中此即反應管;同時做兩支對照管,其中1支試管加2.9ml反應混合液和0.1ml PBS (不加酶液)作為da光還原管,另1支加2.9ml反應混合液和0.1mlPBS同時用錫箔紙包好遮光用于測定時調零。

                (3)將試管置于光照培養箱中在4000lux光照25°C下反應20min;

                (4)反應結束后以不照光的對照管調零,分別測定各管在560nm下的吸光度(OD560 )

                計算結果

                已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一-個酶活單位(U),

                按下式計算活性n=[(ODmax 0D560)/0Dmax]/2

                SOD總活性= [( Ack-AE)XV]/ (1/2AckXWXVt)

                SOD比活力=SOD總活性/蛋白質含量

                SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW);比活力單位以酶單位每:毫克蛋白表示;

                 Ack 為照光對照管的吸光度;

                AE 為樣品管的吸光度;

                 V為樣品液總體積(ml);

                Vt 為測定時的酶液用量(ml); W為樣品鮮重(g);

                蛋白質含量單位為mg/g。

                注意事項

                1.酶液提取須在4℃下進行,提取后立即進行測定,冰箱中放幾小時活性也會下降;

                2.植物中的酚類物質對測定有干擾,制備粗酶液時可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)pvpp等,盡可能除去植物組織中的酚類等次生物質。

                3.NBT反應液配好后過濾除去不溶物立即使用,若置于冰箱中要避光保存,充分搖勻然后使用。

                4.加反應液時hao在暗光下進行;

                5.核黃素產生02,NBT還原為藍甲躦都與光照密切相關,照光強度和時間要嚴格控制。光照培養箱內壁裱糊錫箔紙,使箱內均勻光照約達40μ molms,同時使照光時間一一樣,選擇試管盡量- -致,照光結束后測-一個拿一個(hao.上做) (溫度高時照光時間縮短,溫度低時延長);

                6.測定活性時加入的酶量,以能抑制反應的50%為佳。(一個酶單位相當于引起反應液達到半抑制時酶的用量,即以能抑制反應50%的酶量為一個SOD酶活性單位。)(反應液中加酶液與PBS調零差異不大,反應液調零與其它兩個則有一定差異。)

                關于美析

                美析主營光譜類儀器:可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、原子熒光光度計、ICP-AES、ICP-MS,生命科學儀器:超微量分光光度計、全自動核酸提取儀,目,我們的產品已廣泛應用于有機化學、無機化學、生物化學、醫藥、環保、冶金、石油、農業等域。同時美析利用在產品機械結構、光學設計、電氣應用和軟件開發方面積累的豐富經驗,結合市場的xin實際需求,近期將陸續推出一批全xin的分析類儀器。

                 

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