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                兩種不同釋放劑核酸提取法的新型冠狀病毒RT-PCR內標檢測結果比較

                提供者:上海美析儀器有限公司   發布時間:2022/4/22 9:09:31  閱讀次數:93次   進入該公司店鋪

                 

                兩種不同釋放劑核酸提取法的新型冠狀病毒RT-PCR內標檢測結果比較

                關鍵詞:

                新型冠狀病毒;核酸提;逆轉錄PCR;內標

                引言:

                新型冠狀病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirusdisease,COVID-19)繼續在全球肆虐。WHO報道,截至2020611111am,全球確診病例6040609例,死亡病例230104例。對SARS-CoV-2進行核酸檢測,是WHO目推薦的識別感染病例的方法。李克強總理主持召開中央應對新冠肺炎疫情工作導小組會議提出:提高新冠病毒核酸檢測能力,加快快速便捷檢測試劑和設備研發生產,縮短檢測時間,推進重點人群“應檢盡檢”、其他人群“愿檢盡檢”,推動各地互通互認檢測結果,促進精zhun防控、人員流動和全mian復工復產。

                深圳市寶安中醫院(集團)檢驗科PCR實驗室自2020310日開始SARS-CoV-2的核酸檢測工作,截至2020511日,共檢測19522份標本。采用中山大學達安生物有限公司生產的“新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)”,試劑盒采用的內標(IC)為人類RNaseP基因(RP)。在實驗工作中,經常出現內標擴增曲線不出現典型“S”型或者內標完quan無擴增曲線的情況,導致重復檢測,拖延了報告發放時間,給臨床診療工作帶來不便。本實驗室在經過一系列實驗之后,對達安公司試劑盒說明書中給出的實驗方法進行了部分更改優化,經優化實驗步驟后,內標的擴增曲線及起始循環Ct值均有明顯改善,現具體報道如下。

                一、對象與方法

                1.1實驗材料

                1.1.1實驗試劑和儀器

                 H32/48核酸提取儀(美析儀器);

                新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)和樣本釋放劑;

                熒光定量PCR擴增儀;超恒溫水槽;

                多管快速混合器;

                迷你離心機;

                1.1.2實驗對象

                2020310日至2020511寶安中醫院發熱門診、復工門診及隔離病房送檢的進行SARS-CoV-2的核酸檢測的咽拭子標本共19522份。

                1.1.3咽拭子采集及保存

                采樣人員著三防護,用達安公司生產的用樣本采集拭子擦拭扁桃體和咽后壁,將拭子頭浸入含有樣本保存液和核酸釋放劑的保存管中。樣本采集完后置0~4℃保存,24h內完成檢測。

                1.2實驗方法

                實驗及醫護人員均嚴格按照國家衛生健康委辦公廳印發的《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》及《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》等相關文件進行實驗操作和生物安全防護。

                1.2.1原樣本釋放劑使用說明書中實驗方法

                將樣本采集管置于56℃水浴箱滅活30min,室溫條件下,將采集管振蕩1min,靜置5min,重復3次后,瞬時離心,直接吸取上清液5μL為模板加入PCR體系進行擴增。

                1.2.2本實驗室優化后實驗方法

                樣本采集管置于56℃水浴箱滅活40min[8-9]。室溫條件下,2800r/min充分振蕩2min,立即4000r/min離心30s,直接吸取上清液5μL為模板加入PCR體系進行擴增(加樣時如吸到雜質或混濁物棄去,重新吸取上層澄清液體)。

                1.2.3優化后實驗方法的陽性標本檢測性能評價

                2020第yi次廣東省臨檢中心室間質量評價(externalqualityassessment,EQASARS-CoV-2陽性標本7份(2020004~2020010),用1.2.11.2.2所述方法分別檢測,每份樣本平行檢測3次,重復3次實驗,觀察兩種方法對陽性結果Ct值的影響。

                1.3統計學分析

                采用GraphPadPrism7.00軟件分析統計數據,計量資料用(x±s)表示,采取單因素方差分析與配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

                二、結果

                2.1優化后各樣本內標擴增曲線比較

                優化,各樣本內標擴增曲線在Ct24~44之間散在分布,Ct38之后大多無明顯“S”型曲線,不少樣本內標未出現擴增曲線;經優化后,各樣本內標的擴增曲線明顯優于優化,擴增曲線集中在22~34之間,且全部呈現典型“S”型曲線,見圖1。

                2.2優化后復查率比較

                經優化后,樣本復查率較優化有明顯下降,差異有統計學意義(F=3.889,P=0.0258),結果詳見表1,圖2A。

                2.3優化后各樣本內標Ct值比較

                經優化后,各樣本內標的擴增起始循環Ct值明顯小于優化(t=5.937,P<0.01),陽性對照N基因及ORF1a/b基因的Ct值,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

                2.4優化后陽性質評標本Ct

                優化后,陽性質評標本N基因(F=1.032,P=0.9701)ORF1a/b基因(F=1.262,P=0.7848),Ct值均無統計學意義(P>0.05)。見圖3。













                三、討論

                2003SARS-CoV-22012MERS-CoV引起的流行病學數據證明,對COVID-19建立快速、高通量、高敏感及高特異性的實驗室診斷對于病例早診斷、密切接觸者追蹤和感染控制措施合理化制定至關重要。因為SARS-CoV-2至少需要3d才能在選定的細胞系中引起明顯的細胞病變,且病毒分離培養需要3生物安全設施,大多數醫療機構都不具備,因此以病毒培養來建立快速診斷是不現實的;而SARS-CoV-2SARS-CoV存在82%的基因同源性,血清學抗原抗體檢測可能存在交叉反應[11]。由于這些局限性,應用逆轉錄-PCRRT-PCR)技術對SARSCoV-2進行核酸檢測仍然是主要的全球COVID-19切實可行的實驗室診斷檢測方法。

                雖然因為“假陰性”的問題使得SARS-CoV-2核酸檢測存在爭議,自2020115日至315日,國家衛生健康委員會先后共發布了七版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行1-7版),核酸檢測陽性一直是確診病例的診斷標準之一。由于國內大部分檢測點都是采集咽拭子做為標本,在疾病早期或是無癥狀潛伏期,上呼吸道局部病毒載量低;標本采集后沒有按正確方法貯存及運輸等等原因都可能造成檢測結果的假陰性。另外,由于新冠病毒在呼吸道是寄生于呼吸道上皮細胞,如果沒有采集到足夠數量的細胞,也會造成檢測結果的假陰性。因此,目國內各檢測試劑公司開發的試劑盒內多采用了RNaseP基因(RP)做為內標(IC),來監測標本是否采集合格。在結果判讀時,如果IC沒有出現典型的擴增曲線或者Ct>40,則被認為標本質量差,沒有采集到足夠的人類上皮細胞,需要復查。

                本實驗室采用的達安公司出品的“新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)”也是采用RP做為IC。同時為了da程度減少職業暴露,加大生物安全防護力度,達安基因在開發試劑盒的同時,推出了采用樣本釋放劑一步法提取SARS-CoV-2核酸,力求在病毒核酸提取操作時減少開蓋次數,減少暴露風險,從而在da程度保護實驗人員的基礎上高質高xiao地提取到足夠數目的RNA模板進行擴增。

                但是在實驗過程中,發現經一步法提取核酸進行擴增后,經常有IC沒有典型的擴增曲線或者Ct>40的情況。此種情況,一般只能延遲報告發放,同時實驗室采用達安基因給出的補救方法進行進一步的復查實驗,IC出現典型的擴增曲線且Ct<40后,實驗室才能發放報告。大多數標本在經補救方法復查后,IC會有典型的“S”型擴增曲線。但仍有少部分補救方法處理后仍有IC無擴增現象,則考慮為標本質量不合格,通知臨床科室重新采集標本送檢。由于臨床上發熱門診及手術室都依據SARS-CoV-2核酸檢測結果才開展下一步的診療,報告發放的延遲給臨床上的診療工作帶來了一定的影響。因此,降低復查率勢在必行。

                目主流的磁珠法提取核酸過程中由于磁珠與核酸的特異性結合使得提取的核酸純度高,濃度大,并且靈敏度,重復性都很好。而一步法雖然快速高xiao,但卻沒有磁珠法提取的核酸純度高,可能是一步法提取的核酸模板中存在有非特異性物質干擾其與引物的特異性結合,導致擴增結果不理想。因此,本實驗室考慮優化實驗方法,延長振蕩時間至2min,力求讓標本中的核酸充分釋放;增加了離心力和離心時間,并且確保吸取上層澄清液體加樣,從而減少非特異性物質的干擾。

                優化后比較的結果顯示,優化,樣本中內標的擴增曲線會有少數沒有出現典型的“S”型,且有個別內標沒起,平直地處于閾值線以下的情況,Ct值明顯靠后且分散;經優化后,不但所有樣本的內標都出現了典型的“S”型擴增曲線,而且擴增起始循環Ct值的平均值明顯小于優化;同時陽性對照N基因與ORF1a/b基因Ct值與優化比較差異無統計學意義。實驗中采用了廣東省臨檢中心下發的2020第yi批次的室間質評陽性標本對優化方法的陽性標本檢出能力進行性能評價,結果各標本的N基因及ORF1a/b基因Ct值兩種方法比較差異無統計學意義。這說明在不影響陽性標本檢測結果的情況下,優化方 法大大提高了內標的檢出率,復查率從優化的2.226%降至0.679%,整體較優化有了明顯地改善。

                經過優化后,雖然大大提高了內標檢出率,但還是存在一定比例的復查率,很多內標不出的標本出現或渾濁、或粘稠、或為咖啡色血性樣本,存在太多干擾物影響檢測結果,因此建議臨床科室重新采集標本送檢。并加強對標本采集人員的技術培訓。

                科室由于實驗室設備及人員緊張,暫時不具備應用磁珠法提取SARS-CoV-2核酸的條件,故整個實驗過程僅是優化后方法比較,存在一定的局限性。本實驗室2020年兩次參加廣東省臨檢中心SARS-CoV2核酸檢測室間質評成績均為優xiu,表明雖然釋放劑一步法提取核酸的效率沒有傳統磁珠法高,但尚可滿足臨床診療及復工復學篩查需求。此法操作簡便,降低了實驗室工作人員的職業暴露風險,且經本實驗室優化部分實驗操作后,實驗結果可接受。

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